从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide（3）：结合得好，还远远不够

从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide · 第 3 篇

上一篇：第一次“看见”环肽如何结合 PCSK9

Compound 30 不是终点

在上一篇中，研究人员终于第一次看清了 Compound 30 如何结合 PCSK9。对于一个药物发现项目来说，这当然是重要突破：它的 potency 很好，共晶结构已经获得，binding mode 也开始能够被解释。但 Compound 30 仍然不是一个药物。它依然容易受到蛋白酶降解，在体内也会很快被清除。

项目的问题由此发生了变化。研究团队不再只是寻找“能够识别 PCSK9 的环肽”，而是要在保留这种 recognition 的同时，让分子在 binding assay 之外也足够稳定，并具备更完整的 developability。一个出色的 binder，从这里开始面对药物设计更苛刻的一面。

Binding 与 exposure 描述的是分子旅程中不同的环节。Affinity measurement 只回答多肽在受控条件下能否结合靶点；一个真正能在体内发挥作用的分子，还必须先保持完整，到达相关 compartment，避免不可接受的 biological response，并以足够浓度停留足够长的时间。Compound 30 很有说服力地回答了第一个问题，后面的旅程却仍然敞开。

用 D-氨基酸保护薄弱位置

晶体结构给出了一条具体线索：一个 Gly 位点可以容纳额外的 methyl group，而不必迫使面向靶点的区域改变原有 arrangement。研究人员把这里的 Gly 换成 D-Ala，得到 Compound 40。它基本保持了原有 potency，同时对 elastase 和 trypsin 的降解表现出更强的耐受性。

新的晶体结构进一步解释了这一结果。D-Ala 多出的 methyl group 指向 solvent，没有破坏已经建立的 binding mode。这并不是在证明“D-氨基酸总能让多肽变好”，而是用非天然氨基酸解决一个非常具体的设计问题：保护容易被攻击的位置，同时尽可能少地扰动 target recognition。

这里的 stereochemical choice 同样关键。增加一个 methyl group，不只会改变局部 steric demand，也可能改变 backbone preference。在这个例子里，共晶结构显示所选择的 D-configuration 把新基团放在了可以容忍的方向。结构信息没有取代 protease assay，而是把测得的稳定性改善与合理的 molecular explanation 连接起来，为下一轮设计提供更可靠的依据。

图 1. 本文涉及的优化路径。该图依据 Alleyne 等人报道的设计步骤绘制，是概念性演化图；圆环仅表示构象约束增加，并非化学结构。Compound 79 的蛋白酶稳定性进一步提高，但同时出现 poor solubility，因此并不是项目终点。

一个问题解决后，又出现新的问题

研究人员继续利用结构信息，重构蛋白酶敏感区域附近的局部 backbone geometry。围绕 Pro–Thr 区域的修改及相关设计，使分子在体外 protease assay 中的稳定性得到明显改善，但 animal PK 并没有同步变得理想。一个分子可以在特定 enzyme assay 中不易降解，却仍可能通过其他途径被清除、出现不利分布，或遭遇原有 assay 根本没有覆盖的问题。

另一个问题随后出现在含 Lys 的 basic analogues 中：mast-cell degranulation。相关 side chain 位于 solvent-exposed position，团队因此可以在不重做 PCSK9 核心界面的情况下改变这里的 chemistry，并降低这一风险。但项目的优化边界已经明显扩大：potency、protease stability、PK 与 safety-related behavior 必须被放在一起考虑，单个 readout 的成功无法抵消其他方面的失败。

这种“一个改善暴露出下一个限制”的节奏，是 multi-parameter optimization 的常态。它并不意味着之前的 modification 没有价值，而是当最突出的弱点被压低后，原本处于次要位置的 property 就可能成为新的约束。项目的进展因此不能只看某一个 assay 是否达到最大值，而要看尚未解决的 liabilities 能否逐步减少，同时不丢掉已经获得的优势。

从一个环变成两个环

结构还揭示了一个仅从一维 sequence 很难发现的机会：多肽链上原本相隔的两个区域，在三维空间中彼此靠近。如果在它们之间增加第二个 cyclization，就可能进一步限制 conformational ensemble，在保护 backbone 的同时保留 PCSK9 所识别的形状。

Compound 78 用 bicyclic lactam 实现了这一构想。它的晶体结构仍与 Compound 30 高度相似，说明增加第二个环可以约束分子，却没有替换原有 binding mode。这一点很重要：第二个环并不是装饰性的 chemistry，而是用来强化一种已经被验证有效的三维 arrangement。

这组结构对照也说明，bicyclization 必须受到结构指导，而不能被机械套用。新的 covalent connection 可以稳定有利构象，也完全可能锁住错误构象，甚至扭曲原有 target contact。Compound 78 的设计先利用三维空间中的接近关系寻找与 bound state 相容的连接方式，再通过新的晶体结构检验这个假设。

此时仍有一个 amide 暴露在外。研究人员对它进行 N-methylation，得到 Compound 79，并显著提高了 protease stability。然而，这项改善带来了新的代价——poor solubility。Compound 79 因此不是成功的最终候选物，更不能被理解为 MK-0616 或它的直接前体。它是另一个富有信息量的设计节点：构象与代谢保护继续增强，但整体 property balance 依然没有完成。

药物设计真正困难的地方

从 Compound 30 到 40、78 和 79 的过程，展示了不同技术怎样各自推进项目，却无法单独解决全部问题。mRNA Display可以为困难的蛋白表面找到高质量 starting point；structure-based design 能够帮助区分哪些位置参与 recognition，哪些位置仍有修改空间；D-氨基酸、N-methylation 和 additional cyclization，则可以更精确地改变环肽的稳定性与构象行为。

真正的药物必须落在一个狭窄得多的交集里。Binding 需要同时兼容 protease 与 metabolic stability、合适的 PK、足够的 solubility、可接受的 safety profile；如果目标是口服，还要解决 permeability 与 exposure。2020 年这篇研究为后续 oral PCSK9 cyclic peptide 的开发建立了基础，但它并没有报道 Enlicitide，也没有解决口服生物利用度。

Solubility 尤其能说明这些性质之间怎样彼此牵连。让环肽更加刚性或遮蔽 backbone amide 的 modification，可能提高稳定性，却也可能改变 hydration、aggregation 以及溶液中能够达到的浓度。理想性质并不是可以逐项累加的清单；它们必须同时存在于同一个分子里，并在真实给药条件下彼此兼容。

即使完成了这些推进，还有一个更困难的问题没有回答：这样一个远大于传统小分子的环肽，怎样真正实现口服？

下一篇：从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide（4）：一个环肽，怎样开始变成口服药？

系列阅读： 第 1 篇：故事从一次筛选开始｜第 2 篇：第一次“看见”环肽如何结合 PCSK9｜第 3 篇｜第 4 篇：一个环肽，怎样开始变成口服药？｜多肽药物

科学来源与相关阅读

Alleyne C, Amin RP, Bhatt B, et al. Series of Novel and Highly Potent Cyclic Peptide PCSK9 Inhibitors Derived from an mRNA Display Screen and Optimized via Structure-Based Design. Journal of Medicinal Chemistry. 2020;63(22):13796–13824. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c01084

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