从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide（2）：第一次“看见”环肽如何结合 PCSK9

从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide · 第 2 篇

上一篇：故事从一次筛选开始

一张晶体结构，为什么会改变一个药物发现项目？

这个系列的第一篇停在了多肽发现中一个熟悉却并不轻松的位置。mRNA Display 已经找到了能够结合 PCSK9 的环肽，早期 medicinal chemistry 也让被选中的 scaffold 变得更小、活性更好，但研究团队仍然主要依赖间接证据。一个 substitution 可以让活性提高，另一个 modification 可能让活性消失，truncation 则能说明原始 hit 的某些部分并非必需；然而，单凭 assay result 很难解释这些变化为什么发生。

Compound 30 带来了另一种意义上的进展。它的重要性不只是又一次 potency improvement，而是让研究人员获得了这个环肽系列的第一张 PCSK9–macrocycle co-crystal structure。此前散落在实验结果中的 empirical SAR，从这一刻开始拥有了可以直接观察的 molecular binding mode。

PDB 6XIB 中的 Compound 30 是一个由 11 个残基组成的大环肽。它包含两个 5-fluorotryptophan（5F-Trp）和一个 α-methylproline（α-Me-Pro），两处 cysteine side chain 则通过来源于 1,3-di(bromomethyl)benzene 的 DBX bridge 相连。这些细节之所以重要，是因为晶体中的分子并不是一个 generic peptide ring；它的非天然化学和环化方式本身就是 PCSK9 所识别对象的一部分。

图 1. Compound 30：PCSK9 环肽优化中的关键分子。该结构依据 6XIB 的 polymer sequence、modified-residue definition 与 covalent-link record，使用 RDKit 重新构建，并非论文图的截图。序列为 Cys–Lys–Gly–5F-Trp–5F-Trp–Asp–His–Tyr–α-Me-Pro–Cys–Ala，两处 cysteine sulfur 通过 DBX bridge 相连。

从“哪些修改有效”到“为什么这些修改有效”

在缺少可靠 complex structure 时，medicinal chemistry 往往从受控比较开始：改变一个残基，重新测量活性，再判断分子是否变好。随着结果积累，这种方式可以建立非常有用的 SAR，但解释仍然不完整。一次活性损失可能来自直接 target contact 被移除，也可能来自环肽 preferred conformation 被破坏，还可能与溶解度等分子性质变化有关。

共晶结构不会取代实验，却会改变实验能够回答的问题。研究人员现在可以把每个残基放回蛋白表面的真实环境中观察：assay 中显得重要的 side chain，可能直接参与 target recognition；能够容忍 substitution 的位置，可能面向 solvent；另一些看似没有直接接触蛋白的残基，则可能在帮助环肽保持 binding-competent shape。

这就是 empirical SAR 走向 structure-based design 的转折。结构并不意味着每一次成功修改都能被提前预测，而是让每个 chemical modification 都可以对应一个明确的 molecular hypothesis，再交给下一轮实验检验。同样的原则也适用于围绕已有多肽开展 structure-aware optimization：计算和结构模型可以帮助排列假设优先级，但真正的 binding 与 developability data 仍然来自实验。

图 2. Compound 30 如何结合 PCSK9。该原创结构图使用 1.55 Å X-ray structure PDB 6XIB 的真实 atomic coordinates 渲染。PCSK9 以浅蓝色 surface 表示，Compound 30 以 sticks 突出；为保持清晰，图中省略了结晶水与 glycerol，也没有推测坐标中不存在的相互作用。

一个非天然氨基酸为什么如此重要？

最初的 mRNA Display campaign 已经把 5-fluorotryptophan 纳入可探索的 amino-acid set。Compound 30 让这个 library design 决策变得更加具体：6XIB 中的环肽包含两个 5F-Trp，而共晶结构让这些较大的 aromatic side chains 在 PCSK9 表面所处的局部环境第一次可以被直接观察。

把 fluorination 写在序列里，看起来只是一个很小的 chemical edit。但在三维结构中，即使很小的 substitution，也可能改变 side chain 如何占据局部空间、如何分布电子密度，以及如何与周围环境达到平衡。这里真正值得记住的并不是“氟化一定有利”，而是一个 noncanonical amino acid 可以参与非常具体的 molecular recognition；它的价值取决于所在位置、整体构象和 target context。

这也解释了为什么在 library construction 阶段引入非天然氨基酸，可能比只在 screen 结束后逐个尝试 modification 更有价值。selection 可以直接评价修改后的 chemistry 是否属于有效 binding molecule 的一部分。关于这一 discovery context，可继续阅读为什么 mRNA Display 特别适合非天然氨基酸和环肽发现。

环肽的“形状”开始变得和序列一样重要

多肽序列是一维描述，而靶点真正遇到的是一个三维分子。对于大环肽，这个三维对象由 sequence、noncanonical chemistry、cyclization geometry 以及它们共同形成的 conformational preference 决定。

Compound 30 很好地说明了这种区别。DBX bridge 并不只是在纸面上连接两处 cysteine，它会限制多肽链能够采用的构象，并影响哪些 arrangement 更容易出现。α-Me-Pro 也不只是插入序列的一个 residue name；它的 backbone substitution 会改变局部 conformational landscape。这些约束可以帮助 target-facing side chain 处于合适的位置，而不要求每一个 constraining element 都必须直接接触 PCSK9。

因此，共晶结构让第二层 SAR 变得可见：有些修改因为改变直接 contact 而影响 recognition，另一些修改则可能通过改变展示这些 contact 的整体形状发挥作用。从这里开始，sequence、chemistry、conformation 与 target interaction 已经不能再被彼此独立地解释。

结构告诉研究人员“哪里可以动”

一张真正有用的结构并不只是圈出一个不能改变的 binding motif。它开始把环肽的不同区域区分开来：有些部分位于 recognition 的核心，需要非常保守地处理；有些部分主要帮助维持 bound conformation；还有一些区域更接近 solvent-exposed，可能为调整分子性质留下空间。

这种区分之所以重要，是因为项目接下来面对的问题已经远远不止 affinity。研究团队仍然需要改善 protease stability、metabolic behavior、solubility、permeability、pharmacokinetics，并最终处理 oral exposure。一个 solvent-facing position 可能容许旨在调整溶解度的修改；一个 conformational position 可能被用来降低柔性或保护容易降解的 backbone region；而 target-facing residue 的改变，则往往承担更高的 binding loss 风险。

这些判断都不应被当作保证。晶体结构只是一个 snapshot，分子在 solution 中仍然具有动态 ensemble，一项化学上看似合理的设计也可能因为单一结构中不可见的原因而失败。但结构把缺少方向的 modification 变成了可检验的选择：保留这里的 recognition，约束那里的 conformation，再从暴露区域寻找改善性质的机会。

从一张结构开始，问题变了

mRNA Display 回答的是：“什么样的环肽能够结合 PCSK9？”第一张共晶结构开始回答：“它为什么能够结合？”从这一刻起，项目可以提出一个更困难的问题：怎样在不破坏这一 recognition mode 的前提下，让分子变得更稳定、更接近药物？

这才是 Compound 30 真正重要的地方。它没有完成优化，也不是 Enlicitide。它为 medicinal chemists 提供了一张进入下一阶段的 molecular map。

上一篇：故事从一次筛选开始

下一篇：结合得好，还远远不够

Structure-guided D-氨基酸替换、额外环化与 N-methylation 在改善稳定性的同时，也暴露出新的 PK、安全性与溶解度问题。

科学来源与相关阅读

Alleyne C, Amin RP, Bhatt B, et al. Series of Novel and Highly Potent Cyclic Peptide PCSK9 Inhibitors Derived from an mRNA Display Screen and Optimized via Structure-Based Design. Journal of Medicinal Chemistry. 2020. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c01084

RCSB Protein Data Bank. PCSK9(deltaCRD) in complex with cyclic peptide 30. PDB 6XIB，X-ray diffraction，1.55 Å。https://www.rcsb.org/structure/6XIB

相关服务与资料： mRNA Display 技术资料｜AI 多肽设计｜定制多肽合成