从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide（1）：故事从一次筛选开始

从 mRNA Display Hit 到 Enlicitide · 第 1 篇

一个 mRNA Display hit，距离真正的药物究竟有多远？

Enlicitide（MK-0616）的开发，使口服大环肽成为近年来多肽药物领域最值得研究的案例之一。今天回头看这个项目，很容易把它概括成一句话：“通过 mRNA Display 发现 PCSK9 环肽，随后优化成为口服药物。”但真正的药物发现过程远比这句话复杂。

如果从最初的 mRNA Display screening 开始追踪这条路线，一个更值得回答的问题是：mRNA Display 究竟为药物发现提供了什么？筛选得到一个能够结合靶点的环肽之后，距离真正可以开发的药物分子还有多远？

2020 年，Alleyne 等人在 Journal of Medicinal Chemistry 系统报道了一系列来源于 mRNA Display screening 的 PCSK9 环肽抑制剂。不过，这些成果并不是 mRNA Display 筛选本身直接产生的。故事的起点，要从 PCSK9 这个靶点以及最初筛选得到的不同环肽系列说起。

一个已经知道“应该抑制”，却不知道“怎样抑制”的靶点

PCSK9 并不是一个缺乏验证的靶点。它参与调节人体血液中的 LDL 胆固醇水平。简单来说，PCSK9 会促进 LDL receptor（LDLR）的降解；阻断 PCSK9 与 LDLR 的相互作用，可以让更多 LDLR 回到细胞表面，继续帮助清除血液中的 LDL 胆固醇。

抗 PCSK9 抗体已经证明，这条通路在临床上是有效的。因此，当研究人员开始这个项目时，最大的科学风险并不是“不知道 PCSK9 有没有用”，而是另一个问题：能不能用比抗体小得多的分子，阻断 PCSK9 与 LDLR 之间的相互作用？

这并不容易。PCSK9 与 LDLR 接触的地方并不是一个典型的小分子结合口袋，而是一片相对宽阔、平坦的蛋白表面。对于传统小分子来说，这类 protein–protein interaction 往往很难处理。

大环肽因此成为一个很有吸引力的选择。它比普通小分子大，可以与蛋白形成更广泛的接触；但又远小于抗体。如果能够找到合适的序列和三维构象，大环肽理论上可以很好地填补两者之间的空间。这并不意味着大环肽天然就具备口服生物利用度；在故事的这个阶段，问题只是：一个能够识别 PCSK9 的环肽究竟长什么样？

与其猜，不如筛

如果一个环肽有十几个氨基酸，即使只使用天然氨基酸，可能的序列数量也已经是天文数字。再加入非天然氨基酸、不同的立体化学和环化方式，可能的化学空间会进一步扩大。

依靠研究人员逐个设计、合成和测试，几乎不可能真正探索这样的空间。

这正是 mRNA Display 特别适合非天然氨基酸和环肽发现的地方。

它的思想其实很直观：让每一个多肽都和编码自己的 mRNA 联系在一起。然后把一个巨大的多肽文库交给 PCSK9 去“选择”。不能有效结合的分子被洗掉，能够结合的分子被保留下来；由于每个多肽都携带自己的核酸“身份证”，研究人员可以知道哪些序列被选中了，再把它们扩增，进入下一轮筛选。希望了解完整筛选过程的读者，也可以继续阅读一轮 mRNA Display selection 中发生了什么。

在这个 PCSK9 项目中，线性肽文库包含两个 reactive thiols，并使用 1,3-di(bromomethyl)benzene（DBX）进行环化。经过多轮选择，一个原本极其复杂的文库逐渐收敛。研究人员最终获得了两个结构不同的环肽 hit 系列，说明 PCSK9 的表面并不是只有一种可能的识别方式。

还有一个特别值得注意的细节：后来被选择继续进行 medicinal chemistry 的 compound 2，并不是两个初始 hit 中活性更强的一个。这说明 screening potency 虽然重要，却不是决定一个 hit 能否成为药物化学起点的唯一标准；一个 scaffold 是否适合缩小、改造和继续优化，同样重要。

这就是后来漫长故事的起点。

图 1. 从巨大化学空间中找到一个起点。mRNA Display 找到了起点，而不是最终的药物。

找到 Hit 以后，故事才真正开始

这里是 Enlicitide 故事中一个很容易被忽略的地方。

mRNA Display 非常擅长回答：“什么样的分子能够结合这个靶点？”

但药物开发真正需要回答的问题远不止这一个。

一个分子能够很好地结合 PCSK9，并不意味着它能够在人体中稳定存在；能够稳定存在，也不意味着它能够穿过肠道；能够被吸收，也不意味着它具有合适的药代动力学；即使这些问题都解决了，还需要考虑溶解度、化学稳定性、合成和规模化制造。

因此，mRNA Display 找到的不是“药”，而是一个值得继续投入时间的起点。

PCSK9 项目很快就证明了这一点。

研究人员把筛选得到的环肽重新合成出来，然后开始做一件非常传统的事情：删掉看起来并不必要的部分。compound 2 的 N-terminal region 被移除和截短，由此得到更小的 analogues；其中 compound 4 成为一个重要的早期 analogue。

结果令人印象深刻。原始 hit 中相当一部分结构被删除以后，分子不但变得更小，活性仍能保持甚至提高。也就是说，mRNA Display 找到了一个能够工作的分子，但这个分子并没有被“优化”成最简洁的形式。真正的药物化学工作才刚刚开始。

这也是整个 Enlicitide 故事中一个很重要的转折。筛选阶段的问题是“谁能结合 PCSK9？”，而从这一刻开始，问题变成了“怎样把这个分子变得更像一个药？”

第一个现实问题很快出现了

当研究人员开始认真评价这些环肽时，很快发现，仅仅“结合得很好”远远不够。

早期分子在多种蛋白酶环境中并不稳定，也存在代谢 liability，在体内半衰期和药代动力学方面受到限制。换句话说，一个在体外实验中表现不错的 PCSK9 inhibitor，进入真正的生物环境以后，会遇到完全不同的问题。

这实际上是多肽药物开发中一个非常典型的矛盾。多肽之所以能够高效识别蛋白，部分原因正是它拥有丰富的主链和侧链化学；但这些结构同时也可能成为蛋白酶识别和降解的对象。要把一个高亲和力多肽变成药物，就必须在“保持结合”和“改变分子性质”之间不断寻找平衡。

幸运的是，这一次研究人员不需要完全从头开始。

他们已经有了一个能够结合 PCSK9 的分子。接下来可以逐渐找出哪些部分不能动，哪些部分可以改变，以及哪些结构正是造成不稳定的原因。

这就是 medicinal chemistry 开始发挥作用的地方。

非天然氨基酸其实从故事开始时就已经出现

还有一个细节特别值得注意。

PCSK9 项目的 mRNA Display 文库并不是一个只包含标准天然氨基酸的简单文库。其中已经使用了非天然氨基酸，例如 5-fluorotryptophan（5F-Trp）。

后来的实验发现，其中一个 5F-Trp 对环肽与 PCSK9 的结合非常重要。作者甚至明确指出，在最初的 mRNA Display campaign 中把 5F-Trp 放进可探索的氨基酸集合，对发现这一系列分子是关键的。

这件事的意义比一个具体的 SAR 数据更重要。

如果 display library 只允许使用天然氨基酸，那么无论文库做得多大，它探索的仍然只是一个受到限制的化学空间。把非天然氨基酸直接放进筛选体系，意味着 selection 可以自己决定这些新的化学结构有没有价值，而不是等得到天然肽 hit 以后，再由药物化学家逐个尝试加入。这并不意味着任意 NCAA 都能被编码；具体 incorporation 仍然取决于 translation system 和 building block。更多背景可参阅为什么 mRNA Display 特别适合非天然氨基酸和环肽发现。

这也是 mRNA Display 与大环肽、非天然氨基酸结合后真正有吸引力的地方：扩大文库，并不仅仅意味着增加序列数量，也可以意味着扩大可被实验选择的化学空间。

mRNA Display 真正解决的是“从哪里开始”

今天我们已经知道这个项目后来走得非常远。但如果回到最初的 mRNA Display screening，当时并没有人知道这些环肽最终能不能成为口服药物。

研究人员首先得到的，只是几个能够识别 PCSK9 的环肽。

其中一个系列被选出来继续开发。分子被缩小，活性被重新验证，很快又暴露出稳定性和体内行为的问题。接下来还需要解决构象、代谢、溶解度、通透性、口服吸收以及制造等一系列问题。

从这个角度看，Enlicitide 的故事并不是“mRNA Display 筛出了一个药”。

它真正说明的是另一件事情：

面对一个传统小分子难以处理的蛋白表面，mRNA Display 可以从巨大的化学空间中找到一个值得开始药物开发的分子。

而在药物发现中，找到一个真正值得开始的地方，本身就是一件非常困难的事情。

mRNA Display 找到了这个起点。

距离 Enlicitide，还很远。

但故事已经开始了。

下一篇：第一次“看见”环肽如何结合 PCSK9

早期环肽暴露出可开发性问题的同时，结构生物学也开始揭示这个 scaffold 如何识别 PCSK9 宽阔的蛋白表面。下一篇将沿着最初的结构信息继续追踪：当研究人员第一次“看见”环肽与 PCSK9 的结合方式以后，medicinal chemistry 能够提出哪些新的优化问题？

科学来源

Alleyne C, Amin RP, Bhatt B, et al. Series of Novel and Highly Potent Cyclic Peptide PCSK9 Inhibitors Derived from an mRNA Display Screen and Optimized via Structure-Based Design. Journal of Medicinal Chemistry. 2020. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c01084